Formålet med dette ph.d.-studium, som udgår fra Dermato-venerologisk Afdeling, Bispebjerg Hospital, er at bidrage til forståelsen af den funktionelle betydning af kolesterol og mikrodomæner i keratinocytcellelinjen HaCaT.

Studier af modelmembraner har vist, at lipider spontant kan fordeles i domæner, der består af enten ordnede eller uordnede lipider. Nanometerstore lipid rafts antages at eksistere i levende cellers plasmamembraner og at være opbygget som de ordnede domæner, der har nedsat molekylær bevægelighed. Da mange af plasmamembranens proteiner er lokaliseret i rafts, formodes disse at spille en kritisk rolle i plasmamembranens funktioner.

Med konfokal mikroskopi har vi påvist, at fluoresceinkonjugeret koleratoksin B-subenhed (CTB-FITC) danner mikrometeransamlinger af raft -markøren gangliosid GM 1 (CTB bright -domæner). Da receptoren for epidermisvækstfaktor (epidermal growth factor receptor , EGFR) er den vigtigste receptor for keratinocytters homøostase, undersøgte vi, om destruktion af ordnede domæner med kolesterolekstraherende agenser påvirker funktionen af denne receptor. Såvel methyl-β-cyklodextrin (MβCD) og filipin III forårsager en omfordeling af EGFR fra CTB bright -domænerne til den omgivende plasmamembran og en liganduafhængig stimulation af signalering via EGFR.

På basis heraf formodede vi, at CTB bright-domæner i HaCaT keratinocytter er lipid raft-domæner. Imidlertid kolokaliserer markører for de uordnede domæner såsom 1,1´-dioctadecyl-3,3,3´,3´-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI-C 18:0), Alexa Fluor (AF)-transferrin og en markør for fokale adhæsioner, α4β1 også med CTB bright -domænerne. Med teknikken fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) fandt vi, at den laterale bevægelighed af CTB-FITC, EGFR, DiI-C 18:0 og AF-transferrin var nedsat i de fokale adhæsioner, som derved får karakter af at være sier, der begrænser den molekylære bevægelighed.

I den apikale HaCaT-plasmamembran observerede vi sfæriske, afsnørende vesikler på 1-2 mikrometer, der hovedsagligt var mærket med DiI-C 18:0 . MβCD forøger antallet af disse vesikler. Da ordnede og uordnede domæner har forskellige biofysiske egenskaber, opstår der energi på lipiddomænegrænsen. Energiregnskabet viste sig at favorisere dannelsen af 1-2 mikrometer-vesikler, som består af lipider fra de uordnede domæner. Vi konkluderer, at domænegrænseenergien er en vigtig faktor for dannelsen af vesikler i levende celler.

Disse studier bringer kolesterol og mikrodomæner i keratinocytplasmamembranen i et nyt lys i forhold til reguleringen af cellulære processer som cellesignalering, celleadhæsion og dannelse af vesikler. Set i et fremtidsmæssigt perspektiv kan farmakologisk manipulation af membrankolesterol blive en ny terapeutisk mulighed.