|
|
|
| Ugeskr Læger 2001;163(41):5652
|
ORIGINAL MEDDELELSE
Cand.scient. Maria Kirchhoff, bioanalytiker Hanne Rose, civilingeniør Tommy Gerdes & Claes Lundsteen
Resumé
Introduktion:
Formålet var at påvise kromosomfejl hos dysmorfe og mentalt retarderede patienter med normal karyotype ved hjælp af komparativ genomisk hybridisering (CGH).
Materiale og metode:
144 patienter med normal karyotype fik foretaget CGH-undersøgelse med en ny detektionsteknik, hvor faste detektionsgrænser var erstattet med et dynamisk standardreferenceinterval, hvilket giver en bedre opløsning og derved påviser selv mindre kromosomfejl.
Resultater:
Der blev fundet 15 små kromosomfejl (10%) samt en trisomi 9-mosaik. Elleve af de små kromosomfejl var interstitielle deletioner eller duplikationer, som ikke kan påvises ved screening med andre cytogenetiske teknikker. Tre var terminale deletioner eller duplikationer, og en var en terminal ubalanceret translokation.
Diskussion:
CGH-undersøgelse med anvendelse af dynamiske standardreferenceintervaller er en ny, objektiv, kvantitativ metode, der er velegnet til screening for små kromosomfejl, som ikke detekteres ved konventionel kromosomundersøgelse. Det anbefales, at metoden benyttes til undersøgelse af dysmorfe og mentalt retarderede patienter, hvor der ikke er fundet abnormiteter ved almindelig karyotypering.
Ved en kromosomundersøgelse screenes hele genomet for kromosomfejl. Strukturelle kromosomfejl som fx deletioner, translokationer og inversioner påvises på grundlag af de forandringer, de medfører i kromosomernes båndmønstre. På gode, båndfarvede metafasepræparater kan man påvise deletioner i størrrelsesordenen 5-10 megabasepar. En større opløsning kan opnås ved anvendelse af profase- eller prometafaseanalyse, idet kromosomerne her er længere og har flere bånd. Metoderne er imidlertid vanskelige at anvende på grund af variationer i båndmønstrene, og de er ikke velegnede til screening. Inden for de sidste ti år er der udviklet nye molekylærcytogenetiske metoder, der har en bedre opløsning end den almindelige kromosomanalyse. Ved hjælp af telomerprober kan man påvise små translokationer og deletioner i kromosomernes telomere områder, som ikke kan ses ved almindelig kromosomanalyse (1-4), ved hjælp af multi-colour-FISH og maleprober kan små translokationer påvises (5, 6), og ved hjælp af kommercielt tilgængelige locusspecifikke prober kan man påvise mikrodeletioner som fx DiGeorges syndrom og Williams' syndrom. Med de nye metoder er det således vist, at der findes en lang række sub-mikroskopiske kromosomabnormiteter, der ikke kan påvises ved almindelig kromosomanalyse, men som er årsag til alvorlige syndromer. Ingen af de nævnte metoder tillader imidlertid en screening af hele genomet for mikrodeletioner eller -duplikationer. Komparativ genomisk hybridisering (CGH) er en nyere molekylærcytogenetisk teknik, som anvendes til screening af hele genomet for kromosomale ubalancer, dvs. deletioner og duplikationer (7). Metoden anvendes mest inden for cancerforskningen, men har i de senere år også fundet anvendelse i den kliniske cytogenetik, hovedsagelig til afklaring af komplicerede cytogenetiske forandringer (8-15). Opløsningen ved almindelig CGH-undersøgelse er kun ca. ti megabasepar, dvs. lidt ringere end den almindelige kromosomundersøgelse (16). På Rigshospitalet har vi imidlertid forøget sensitiviteten og specificiteten af CGH-undersøgelsen (17, 18), således at vi kan påvise deletioner ned til en størrelsesorden af ca. tre megabasepar (19). Præliminære undersøgelser med denne high resolution-CGH-teknik (HR-CGH) har vist, at vi ved screening kan påvise mikrodeletioner og -duplikationer hos dysmorfe og mentalt retarderede patienter, der har en normal konventionel kromosomundersøgelse (20). I dette arbejde beskrives HR-CGH-teknikken og resultaterne af HR-CGH-undersøgelse af 144 dysmorfe og mentalt retarderede patienter med en normal karyotype, hos hvem vi fandt, at 10% havde en mikrodeletion eller -duplikation.
Materiale og metoder
Materialet bestod af blodprøver fra 144 dysmorfe og mentalt retarderede patienter med normal karyotype og uden en diagnose. Prøverne var indsendt med henblik på HR-CGH-undersøgelse, fortrinsvis fra børneafdelinger her i landet i perioden februar 1997 til december 2000. Otteogfirs af patienterne deltog i en igangværende undersøgelse af 100 dysmorfe og mentalt retarderede børn med normal karyotype, som får foretaget undersøgelse med HR-CGH, telomerprober og SKY-karyotypering (svarer til multi-colour-FISH) (CTS-projektet). De detaljerede resultater af denne undersøgelse vil blive publiceret andetsteds. Kliniske oplysninger om de patienter, hos hvem der blev fundet abnorme forhold ved HR-CGH-undersøgelse, blev indhentet fra de henvisende afdelinger. Kun de patienter, der ikke var med i CTS-projektet, omtales her i detaljer (sygehistorier kan fås ved henvendelse til forfatterne).
Komparativ genomisk hybridisering Princip.
CGH er en teknik, som påviser ubalancerede kromosomforandringer i et helt genom i ét enkelt in situ-hybridiseringstrin (Fig. 1). Ved CGH hybridiseres til normale metafasekromosomer med to prober samtidig. Den ene probe udgøres af totalt genomisk DNA fra det væv, man ønsker at undersøge (test), mens den anden er totalt genomisk DNA fra en karyotypisk normal reference. Test- og reference-DNA mærkes med to forskellige fluorochromer, der fluorescerer henholdsvis grønt og rødt, og begge prober samt et overskud af umærket repetitivt DNA (Cot1-DNA) hybridiseres til normale metafasekromosomer (Fig 1, 1). Intensiteten af de to fluorochromer måles langs kromosomerne ved hjælp af digitalt billedanalyseudstyr (Fig. 1, 2). Kromosomale ubalancer i testgenomet kvantificeres ved at beregne ratio af grøn:rød fluorescens langs kromosomerne (Fig. 1, 3). De kurver, der fremkommer herved, benævnes ratioprofiler. Såfremt test-DNA'et er normalt, vil de normale metafasekromosomer efter hybridisering fremstå i en blandingsfarve af grøn og rød, og ratioprofilerne for alle kromosomerne vil være 1,0 (se dog afsnittet om HR-CGH). X-kromosomet i Fig. 1 er et eksempel herpå. En duplikation i test-DNA'et vil derimod optræde som et grønt område på de tilsvarende normale kromosomer, og ratioprofilen for området vil antage værdier, der er større end 1,0. Omvendt vil en deletion i test-DNA'et ses som et rødt område på de tilsvarende normale kromosomer, og ratioprofilen vil antage værdier, der er mindre end 1,0. Eksempler på begge disse forhold ses for kromosom 17 i Fig. 1. HR-CGH. Konventionelt evalueres CGH-ratioprofiler ved hjælp af faste grænser. Således vil ratioprofiler, der afviger fx 15% eller 20% fra ratio 1,0, typisk blive betragtet som abnorme. Det er dog almindelig kendt, at denne metode indebærer en stor risiko for falsk positive resultater i en del kromosomregioner, hvilket ofte medfører, at disse helt udelukkes af analysen. Ydermere er følsomheden forholdsvis ringe (10-15 megabasepar). På Kromosomlaboratoriet har vi udviklet en metode, hvor CGH-ratioprofiler evalueres ved hjælp af et dynamisk standardreferenceinterval i stedet for faste grænser. Det dynamiske standardreferenceinterval udgøres af gennemsnittet af 17 CGH-analyser af normale prøver. Baggrunden for anvendelse af en normal standard er observationer, der viser, at profiler fra normale CGH-analyser ofte afviger fra den forventede ratio 1,0, og at disse afvigelser optræder i et mønster, der er karakteristisk for hvert enkelt kromosom. I hvilken grad ratioprofilerne afviger fra 1,0, varierer fra analyse til analyse, men afvigelserne er altid korreleret for alle kromosomer i den enkelte analyse. Det dynamiske standardreferenceinterval udgør således en skalerbar, normal standard, der kan tilpasses den individuelle analyse. Denne tilpasning sker automatisk i billedanalysesystemet. Eksempler på dette er vist i Fig. 2 for kromosom 3 i tre forskellige normale analyser. Ved HR-CGH sammenlignes 99,5% konfidensintervallet af middelratioprofilerne i en given prøve med 99,5% standardreferenceintervallet. Alle områder, hvor disse to intervaller ikke overlapper hinanden, opfattes som ubalancerede (Fig. 3). Ved anvendelse af HR-CGH optræder falsk positive resultater yderst sjældent, og udelukkelse af bestemte kromosomområder er ikke nødvendig. Følsomheden er tilmed forøget mindst tre gange (18, 19). Fremgangsmåde. CGH blev udført som tidligere beskrevet (18). Kort fortalt blev patient- DNA og normalt reference-DNA mærket med henholdsvis FITC-12-dUTP og Texas Red-5-dUTP (Dupont, Boston, MA, USA). Fire hundrede ng af hvert mærket DNA og 20 g Cot1-DNA blev hybridiseret til normale metafasekromosomer. Præparaterne blev hybridiseret i 3-4 dage, vasket og farvet med 4,6-diamidino-2-phenylindol. CGH-billeder blev optaget via en CytoVision-computer (Applied Imaging Corporation, Newcastle, UK) for-bundet med et DM RBE fluorescensmikroskop (Leica, Heerbrugg, Schweiz) og siden overført til og analyseret på et Magiscan billedanalysesystem (Applied Imaging Corporation, Newcastle, UK) eller direkte på CytoVision. For hver patient blev ti metafaser analyseret. Ratioprofiler blev evalueret på grundlag af 99,5% dynamiske standardreferenceintervaller (18) (se endvidere afsnittet om HR-CGH). Reference-DNA til CGH-analyse stammede fra perifert blod fra karyotypisk normale mænd og kvinder. Højmolekylært genomisk DNA blev oprenset på Qiagen Genomic Tip søjle (Qiagen, Hilden, Tyskland) eller med Puregene DNA isolation kit (Puregene, Gentra Systems; Minneapolis, USA).
Resultater
Der blev fundet 16 abnormiteter (11%). Af disse var én en trisomi 9-mosaik (47,XX,+9/46,XX), hvor trisomien blev genfundet i fire ud af 100 metafaser fra dyrket perifert blod ved almindelig kromosomundersøgelse og i 46% udyrkede blodcellekærner ved FISH-undersøgelse. Blandt de resterende 15 strukturelle abnormiteter var der fire duplikationer, ti deletioner og en ubalanceret, telomerisk translokation. Af de 14 duplikationer og deletioner var de 11 interstitielle, og tre var terminale.
Tabel 1 viser en oversigt over de abnorme kromosomfund med undtagelse af de patienter, der indgik i CTS-projektet. Det fremgår, at samtlige otte abnormiteter efterfølgende er blevet bekræftet enten ved G-bånd-analyse, ved FISH-undersøgelse eller ved begge metoder. Alle syv deletioner og duplikationer var nyopståede, mens translokationen var af maternel oprindelse. Hvad angår de otte abnormiteter fra CTS-projektet, er seks på nuværende tidspunkt bekræftet ved G-bånd-analyse eller FISH, og samtlige deletioner og duplikationer er nyopståede. I Fig. 4 ses de otte abnorme HR-CGH-analyser, der ikke indgik i CTS-projektet. På kromosombillederne er de strukturelle abnormiteter, der er bekræftet med G-bånd, angivet med pile. Fem fund blev ikke betragtet som abnormiteter, men som enten falsk positive fund eller som normalvariationer (se diskussionen). Det var tre duplikationer i kromosom 15q12, en duplikation af kromosom 9p11 og en deletion af kromosom 16p11.
Diskussion
Efter at nye molekylærcytogenetiske metoder som multi-colour-FISH og hybridisering med telomerprober og locusspecifikke prober er taget i anvendelse med henblik på påvisning af submikroskopiske kromosomfejl, er det blevet klart, at der forekommer et stort antal mikrodeletioner, hvis størrelse er mindre end opløsningen ved almindelig G-bånd-analyse (1-4). For nylig har en række publikationer vist, at CGH med held kan anvendes i klinisk cytogenetik til afklaring af komplicerede strukturelle abnormiteter (8-15), men opløsningen ved konventionel CGH-analyse er for lille til, at metoden kan benyttes til screening for mikrodeletioner. Vi foretog HR-CGH-analyse på 144 patienter, som var mistænkt for kromosomsygdom, men som havde en normal karyotype, med det håb, at vi ville finde nogle få abnormiteter. Overraskende fandt vi, at hele 15 patienter (10%) havde små kromosomabnormiteter. Desuden fandtes en patient med trisomi 9-mosaik. Et afgørende spørgsmål er, hvorvidt det er de påviste kromosomabnormiteter, der er årsagen til de kliniske symptomer hos de 16 patienter. Et godt, men ikke afgørende, bevis for en sammenhæng mellem kromosomfund og klinik er, at abnormiteterne retrospektivt kan bekræftes ved G-bånd-analyse eller ved FISH, samt at de – bortset fra den fundne translokation – kan vises at være nyopståede. På indeværende tidspunkt tyder vore data på, at der er en sandsynlig sammenhæng mellem genotype og fænotype hos mindst 14 af de 16 patienter. To fund blev betragtet som falsk positive resultater. Det var en duplikation af 9p11 og en deletion af 16p11. Vi har flere gange fundet ubalancer i disse regioner hos normale personer, og de synes at forsvinde, når analysen gentages. Vi betragter dem derfor som tekniske artefakter. Tre duplikationer af 15q12 blev betragtet som normalvarianter. De blev fundet hos en dysmorf patient og hans raske far samt hos en pige med en tilsyneladende balanceret nyopstået t(3;21). Kromosom 15q12-duplikationer – især paternelt deriverede – er beskrevet hos normale personer (21, 22). Elleve af de 15 strukturelle abnormiteter var interstitielle deletioner eller duplikationer. Kun fire var terminale. Det er interessant, fordi interstitielle abnormiteter ikke kan påvises med hverken telomerprober eller multi-colour-FISH. Flere undersøgelser med telomerprober har påvist telomere abnormiteter hos ca. 7,5% dysmorfe og mentalt retarderede patienter (1-4). Det tyder på, at man ved at undersøge denne type patienter med både HR-CGH og telomerprober vil kunne påvise omkring 15% abnormiteter. Det er almindelig kendt, at sværhedsgraden af kromosomsygdom afhænger af størrelsen af den genomiske ubalance. Således fører trisomier eller monosomier af de større kromosomer uvægerlig til spontan abort. Jo større ubalance, jo tidligere spontan abort. Mindre kromosomabnormiteter resulterer i fødsel af dysmorfe og mentalt retarderede børn, hvor sværhedsgraden afhænger af både ubalancens stør-relse og dens placering i genomet. Ubalancerne i denne undersøgelse var alle små, bortset fra trisomi 9-mosaikken, og svarende hertil var de fleste af patienterne kun let dysmorfe og let mentalt retarderede.
Tabel 2 viser en oversigt over de ti hyppigste kliniske fund, der blev gjort hos de 16 patienter. Det ses, at en typisk patient med en mikrodeletion eller –duplikation er psykomotorisk retarderet. Der er ofte lavtsiddende eller misdannede ører. Ofte er der en dybtliggende/flad eller bred næseryg, og ofte er der et fladt baghoved og en fremhvælvet pande. Mange har ekstremitetsmisdannelser af forskellig art, og nogle har medfødt hjertefejl. Disse fund er ikke forskellige fra de fund, man gør hos patienter med større kromosomfejl, men det synes som om, fundene generelt er lidt mindre udtalte hos patienter med små ubalancer. Baseret på resultaterne af denne undersøgelse og vort kendskab til mikrodeletionssyndromer tror vi, at der eksisterer et stort antal dysmorfe og mentalt retarderede patienter, der har små ubalancer i genomet, som ikke påvises ved almindelig kromosomanalyse. Mange af disse patienter er børn, der har gennemgået et utal af kostbare undersøgelser, uden at en diagnose er stillet. Disse børn er en diagnostisk udfordring for børnelægen og den kliniske genetiker. Men de udgør også et stort problem for forældrene, som har svært ved at acceptere, at man ikke kan finde ud af, hvad deres barn fejler, og som måske ikke tør sætte flere børn i verden, fordi de ikke ved, om deres barn har en arvelig sygdom. Ifølge vore resultater kan ca. 10% af disse børn få stillet en diagnose ved hjælp af HR-CGH. For tiden er opløsningen ved HR-CGH begrænset til ca. tre megabasepar, mens størrelsen af de mikrodeletioner, der forårsager fx DiGeorges syndrom og Williams' syndrom, er omkring 1-2 megabasepar. Det vil sige, at ikke alle mikrodeletioner kan påvises ved HR-CGH. Ikke desto mindre anbefaler vi, at alle dysmorfe og mentalt retarderede børn med en normal karyotype undersøges med HR-CGH. Det konkluderes, at HR-CGH er en objektiv, kvantitativ analyse med stor opløsningsevne sammenlignet med konventionel karyotypering, som er en subjektiv metode med en mere begrænset opløsning. HR-CGH er nu kommercielt tilgængelig på CytoVision fra Applied Imaging Corporation (Newcastle, UK).
Summary
Maria Kirchhoff, Hanne Rose, Tommy Gerdes & Claes Lundsteen:
Detection of submicroscopic chromosome abnormalities by comparative genomic hybridisation.
Ugeskr Læger 2001; 163: 5652-7.
Introduction:
The purpose was to detect chromosome abnormalities in dysmorphic and mentally retarded individuals with normal karyotypes by means of comparative genomic hybridisation (CGH).
Material and methods:
One hundred and forty-four individuals with normal karyotype underwent CGH analysis with a new detection technique where fixed limits are replaced by dynamic standard reference intervals. This method provides improved resolution and thereby detects minor chromosome abnormalities.
Results:
Fifteen minor abnormalities (10%) and one trisomy 9 mosaic were found. Eleven were interstitial deletions or duplications, which cannot be detected by screening with other cytogenetic techniques. Three were terminal deletions or duplications and one was a terminal unbalanced translocation.
Discussion:
CGH analysis with dynamic standard reference intervals is a new objective and quantitative method, which is suitable for screening for small chromosome abnormalities that can not be detected by conventional chromosome analysis. The method is recommended for use in the investigation of dysmorphic and mentally retarded individuals, in whom abnormalities are not found by ordinary karyotyping.
Reprints: Claes Lundsteen, klinisk genetisk afdeling 4052, Juliane Marie Centret, H:S Rigshospitalet, DK-2100 København Ø. E-mail: Lundsteen@rh.dk
Ivan Nielsens Fond for Personer med Specielle Sindslidelser takkes for økonomisk støtte.
Litteratur
1. Flint J, Wilkie AO, Buckle VJ, Winter RM, Holland AJ, McDermid HE. The detection of subtelomeric chromosomal rearrangements in idiopathic mental retardation. Nat Genet 1995; 9: 132-40.
2. Knight SJ, Regan R, Nicod A, Horsley SW, Kearney L, Homfray T et al. Subtle chromosomal rearrangements in children with unexplained mental retardation. Lancet 1999; 354: 1676-81.
3. Slavotinek A, Rosenberg M, Knight S, Gaunt L, Fergusson W, Killoran C et al. Screening for submicroscopic chromosome rearrangements in children with idiopathic mental retardation using microsatellite markers for the chromosome telomeres. J Med Genet 1999; 36: 405-11.
4. Knight S, Flint J. Perfect endings: a review of subtelomeric probes and their use in clinical diagnosis. J Med Genet 2000; 37: 401-9.
5. Uhrig S, Schuffenhauer S, Fauth C, Wirtz A, Daumer-Haas C, Apacik C et al. Multiplex-FISH for pre- and postnatal diagnostic applications. Am J Hum Genet 1999; 65: 448-62.
6. Schröck E, Veldman T, Padilla-Nash H, Ning Y, Spurbeck J, Jalal S et al. Spectral karyotyping refines cytogenetic diagnostics of constitutional chromosomal abnormalities. Hum Genet 1997; 101: 255-62.
7. Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D,Rutovitz D, Gray JW, Waldman F et al. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science 1992; 258: 818-21.
8. Daniely M, Aviram-Goldring A, Barkai G, Goldman B. Detection of chromosomal aberration in fetuses arising from recurrent spontaneous abortion by comparative genomic hybridization. Hum Reprod 1998; 13: 805-9.
9. Levy B, Dunn TM, Kaffe S, Kardon N, Hirschhorn K. Clinical applications of comparative genomic hybridization. Genet Med 1998; 1: 4-12.
10. Aviram-Goldring A, Fritz B, Bartsch C, Steuber E, Daniely M, Lev D et al. Molecular cytogenetic studies in three patients with partial trisomy 2p, including CGH from paraffin-embedded tissue. Am J Med Genet 2000; 91: 74-82.
11. Christiaens CG, Vissers J, Poddighe PJ, de Pater JM. Comparative genomic hybridization for cytogenetic evaluation of stillbirth. Obstet Gynecol 2000; 96: 281-6.
12. Lapierre JM, Cacheux V, Luton D, Collot N, Oury JF, Aurias A et al. Analysis of uncultured amniocytes by comparative genomic hybridization: a prospective prenatal study. Prenat Diagn 2000; 20: 123-31.
13. Lestou VS, Desilets V, Lomax BL, Barrett IJ, Wilson RD, Langlois S et al. Comparative genomic hybridization: a new approach to screening for intrauterine complete or mosaic aneuploidy. Am J Med Genet 2000; 92: 281-4.
14. Lomax B, Tang S, Separovic E, Phillips D, Hillard E, Thomson T et al. Comparative genomic hybridization in combination with flow cytometry improves results of cytogenetic analysis of spontaneous abortions. Am J Hum Genet 2000; 66: 1516-21.
15. Turleau C, Lapierre JM, Joly G, Prieur O, Raoul O, de Blois MC et al. CGH as a routine procedure in a clinical cytogenetic laboratory: a one-year assessment. Am J Hum Genet Suppl 2000; 67: 152.
16. Bentz M, Plesch A, Stilgenbauer S, Döhner H, Lichter P. Minimal sizes of deletions detected by comparative genomic hybridization. Genes Chromosomes Cancer 1998; 21: 172-5.
17. Kirchhoff M, Gerdes T, Maahr J, Rose H, Lundsteen C. Automatic correction of the interfering effect of unsuppressed interspersed repetitive sequences in comparative genomic hybridization analysis. Cytometry 1997; 28: 130-4.
18. Kirchhoff M, Gerdes T, Rose H, Maahr J, Ottesen AM, Lundsteen C.Detection of chromosomal gains and losses in comparative genomic hybridization analysis based on standard reference intervals. Cytometry 1998; 31: 163-73.
19. Kirchhoff M, Gerdes T, Maahr J, Rose H, Bentz M, Döhner H et al. Deletions below 10 megabasepairs are detected in comparative genomic hybridization by standard reference intervals. Genes Chromosomes Cancer 1999; 25: 410-3.
20. Kirchhoff M, Rose H, Maahr J, Gerdes T, Bugge M, Tommerup N et al. High resolution comparative genomic hybridisation analysis reveals imbalances in dyschromosomal patients with normal or apparently balanced karyotypes. Eur J Hum Genet 2000; 8: 661-8.
21. Browne CE, Dennis NR, Maher E, Long FL, Nicholson JC, Sillibourne J et al. Inherited interstitial duplications of proximal 15q: genotype-phenotype correlations. Am J Hum Genet 1997; 61: 1342-52.
22. Ludowese CJ, Thompson KJ, Sekhon GS, Pauli RM. Absence of predictable phenotypic expression in proximal 15q duplications. Clin Genet 1991; 40: 194-201.
Antaget den 7. august 2001.
H:S Rigshospitalet, Juliane Marie Centret, klinisk genetisk afdeling.
|
|
|
|
UGESKRIFT FOR LÆGER
Ugeskriftet betinger sig ret til at opbevare og publicere artikler (tekst og illustrationer) også i elektronisk form, fx via cd-rom og Internettet.
Eftertryk eller anden mangfoldiggørelse af Ugeskriftets tekst og illustrationer er kun tilladt med skriftlig tilladelse fra forfatter og redaktion og anførelse af Ugeskrift for Læger som kilde.
Gengivelse af informationer eller citater fra Ugeskriftet må tidligst offentliggøres på datoen (mandage) for det pågældende nummers udgivelse og med angivelse af Ugeskrift for Læger som kilde. |
|
|
|
|
|
