|
|
|
| Ugeskr Læger 2001;163(40):5525
|
|
De første erfaringer i Danmark
ORIGINAL MEDDELELSE
Hans Jakob Ingerslev, cand.scient. Johnny Hindkjær, cand.scient. Cathrine Jespersgaard, bioanalytiker Margit Palmer Lind & Steen Kølvraa
Resumé
Introduktion: Præimplantations genetisk diagnostik (PGD) kan være et alternativ til prænatal diagnostik, hvorved familier med alvorlige arvelige sygdomme kan undgå at få børn med sygdommen. Diagnostikken foretages på befrugtede æg før implantationen og forudsætter derfor IVF-behandling. PGD giver således mulighed for kun at oplægge raske æg, hvorfor senere svangerskabsafbrydelse på grund af afficeret foster undgås.
Materiale og metoder: Aktiviteten i Center for Præimplantationsdiagnostik ved Århus Universitetshospital beskrives siden åbningen i februar 1999. Fluorescens in situ hybridiseringsteknik (FISH) anvendtes til kønsselektion (hæmofili A og Duchennes muskeldystrofi) samt ved translokationsdiagnostik og Polymerase chain reaction (PCR) ved cystisk fibrose.
Resultater: Der er påbegyndt i alt 20 PGD cykluser, hvoraf 15 er endt med oplægning af raske embryoner eller bærerembryoner. Positiv graviditetstest blev opnået efter seks af de 15 transfereringer (40%), hvoraf to resulterede i kliniske graviditeter, heraf én igangværende og én fødsel.
Diskussion: Der er opnået resultater med PGD, som er sammenlignelige med IVF-resultater i almindelighed. Den kliniske graviditetsrate kan dog forekomme lav, men tallene er små. Præimplantations genetisk diagnostik synes at være et realistisk alternativ ved udvalgte arvelige sygdomme, hvor prænatal diagnostik er uacceptabel for parret.
Præimplantations genetisk diagnostik (PGD) kan i visse tilfælde anvendes som erstatning for eller som et alternativ til prænatal diagnostik.
Diagnostikken forudsætter hormonstimulation af kvinden og ægudtagning som ved almindelig IVF. Efter befrugtning af æggene kan der udtages pollegemer til genetisk undersøgelse, men den mest udbredte teknik baseres på blastomerbiopsi efter tre døgns dyrkning. Her udtages én til to blastomerer fra embryonet, som på dette tidspunkt oftest vil være på 4-8-cellestadiet. Blastomererne er principielt genetisk identiske i det tidlige embryon.
Ved molekylærbiologisk genetisk diagnostik er det således muligt at påvise embryoner, som vil udvikle sig til syge individer. I stedet udvælges to raske embryoner til oplægning i livmoderen. Med denne teknik kan man derfor undgå, at familier med stor risiko for alvorlige arvelige sygdomme får børn med denne sygdom, uden at abort, som er en ulempe ved den normale prænatale diagnostik, bliver nødvendig.
Den første behandling med PGD udførtes i 1989 af Handyside og medarbejdere (1). Det var en kønsselektion, baseret på fluorescens in situ-hybridiseringsteknik (FISH), som også anvendes til kromosomsygdomme (2-5). Til diagnosticering af monogent arvelige sygdomme anvendes polymerase chain reaction (PCR). Der er i almindelighed tale om sjældne sygdomme, hvor risikoen for sygt barn ofte vil være på mindst 25%.
Med vedtagelsen af Lov om Kunstig Befrugtning (6) blev PGD tilladt inden for rammerne af en videnskabelig protokol, godkendt af det videnskabsetiske komitésystem.
Loven foreskriver, at PGD kun må foretages i de tilfælde, hvor der er en kendt og væsentlig øget risiko for, at barnet får en alvorlig arvelig sygdom, eller hvor en sådan undersøgelse kan påvise eller udelukke en væsentlig kromosomabnormitet i forbindelse med planlagt IVF-behandling for infertilitet. Man har udtrykkelig valgt at lade sygdommens sværhedsgrad være et afgørende kriterium (7). Nærværende projekt er godkendt af Den Centrale Videnskabsetiske Komité, som har valgt, at der udarbejdes en positivliste (Fig. 1 [se UFL 163/40, p. 5526, 1. oktober 2001]).
Hensigten med nærværende arbejde er at orientere om resultaterne siden åbningen af Center for Præimplantationsdiagnostik ved Århus Universitetshospital i februar 1999.
Materiale og metoder
I forbindelse med åbning af Center for Præimplantationsdiagnostik i februar 1999 informeredes offentligheden om muligheden for præimplantationsdiagnostik ved visse genetiske sygdomme (Fig. 1). Der er siden registreret i alt 50 henvendelser. Blandt disse er ti par, som i øjeblikket er i behandling eller afsluttet med graviditet. Af de øvrige 40 afventer 21 færdigudvikling af den relevante molekylærbiologiske diagnostik på enkeltcelle-niveau, fem afventer, at centret får tilladelse til PGD af Den Centrale Videnskabsetiske Komité, mens yderligere 14 venter på metodeudvikling, som endnu ikke er igangsat.
Nærværende opgørelse omfatter således resultaterne af behandling/diagnostik for de ti par, der i øjeblikket er i behandling. Kvindens gennemsnitsalder var 33,8 år (spændvide 28-40 år). Parrene er henvist med følgende indikationer: hæmofili A (et par), Duchennes muskeldystrofi (tre par), balanceret translokation (to par) (13;14 og 13;15) og cystisk fibrose (fire par).
IVF-behandling
IVF-behandlingen blev foretaget efter sædvanlige principper efter den såkaldte lange nedreguleringsprotokol. Fra 21. cyklusdag i en menstruationscyklus behandledes kvinden i ca. 14 dage med en GnRH-analog (Suprefact s.c., Suprefact nasalspray eller Zoladex). Herefter stimuleredes ovarierne med FSH (Puregon s.c.) i individuelle doser i ca. 10-12 dage. Ved en follikelstørrelse på 18-20 mm blev der givet HCG (Profasi, 10.000 IE s.c.), hvorefter der under UL-vejledning blev foretaget transvaginal oocytaspiration ca. 36-38 timer senere. Oocytterne blev herefter flyttet over i dyrkningsmedium i firebrøndsbakker og inkuberet ved 37°C i en fugtet atmosfære indeholdende 5% CO2. To timer senere tilsattes 150.000 spermatozoer til hvert æg.
Sædprøverne blev behandlet med gradientcentrifugering. ICSI (intracytoplasmatisk sædcelleinjektion) blev udført efter standard procedurer ved efterfølgende diagnostik for cystisk fibrose, eller hvor sædkvaliteten indicerede det (8). Et døgn efter blev oocytterne flyttet til en anden brønd med rent medium og inspiceret for tegn på befrugtning. Efter yderligere to døgn foretoges blastomerbiopsi og dagen efter (fire døgn efter ægudtagningen) foretoges transferering med et embryo-transfer-kateter. Graviditetstest foretoges 14 dage efter ægudtagning. En værdi over 20 IU defineredes som en positiv graviditetstest. Gravide blev rutinemæssigt scannet transvaginalt fem uger efter ET. En klinisk graviditet defineredes som tilstedeværelsen af mindst ét levende foster intrauterint ved denne scanning.
Blastomerbiopsi
Udtagningen af blastomerer fra det befrugtede æg foregik ved en forstørrelse på 400 gange i et invertmikroskop med mikromanipulatorer. Det befrugtede æg blev suget fast med en pipette, hvorefter der blev lavet et hul i zona pellucida med acidified Thyrode's solution, der blev pustet ud af en pipette med en åbning på 10 mm. Gennem dette hul aspireredes en til to celler med en tredje pipette med en indvendig diameter på 35 mm. Blastomeren blev herefter overført til et PCR-rør, hvis der skulle udføres PCR-analyse, eller til et objektglas behandlet med poly-L-lysin, hvis der skulle udføres FISH-analyse.
Polymerase chain reaction (PCR)
PCR til analyse af cystisk fibrose blev udført på en GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems) ved følgende program:
Denaturering i 5 min ved 96°C. Cyklus 1–40: denaturering 30 s ved 96°C, annealing 30 s ved 50°C, elongering 2 min ved 72°C og en final elongering 7 min ved 72°C. Den ene primer var fluorescensmærket, og PCR-produktet analyseredes på en ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
Fluorescens in situ-hybridiseringsteknik (FISH)
Objektglas med blastomer blev forbehandlet med pepsinfordøjelse og fiksering i paraformaldehyd, inden X, Y, 18-proben (Aneu Vysion, Vysis) blev påsat og hybridiseret i 30 minutter under dækglas. Derefter blev præparatet vasket og analyseret i et fluorescensmikroskop. Metoden er i store træk som beskrevet i vejledningen til proben.
Resultater
Molekylærbiologisk diagnostik
Der blev i alt udtaget 254 oocytter, og der udvikledes 160 embryoner, som var egnede til blastomerbiopsi (Tabel 1 [se UFL 163/40, p. 5527, 1. oktober 2001]). I alt 109, respektive 51, embryoner blev herefter undersøgt med FISH eller PCR. Konklusive resultater af analyserne blev fundet ved undersøgelse af 89/109 embryoner med FISH (82%) og ved 28/51 (55%) med PCR. Fordelingen af hanlige og hunlige embryoner ved FISH samt raske, bærere og syge ved PCR fremgår af Tabel 1. Antallet af transfereringer i forhold til påbegyndte cykluser (75%) er tilfredsstillende.
Graviditeter
De ti par, der på nuværende tidspunkt er eller har været i behandling, har modtaget i alt 20 påbegyndte IVF-behandlinger, hvoraf 15 har resulteret i oplægning af i alt 25 embryoner. I fem tilfælde blev behandlingen aflyst. I ét tilfælde aflystes behandlingen på grund af manglende follikeludvikling, i ét på grund af manglende befrugtning og i tre tilfælde på grund af, at der ikke var raske eller egnede embryoner at lægge op i livmoderen.
Der er på nuværende tidspunkt opnået seks positive graviditetstest (30% per påbegyndt cyklus, 40% per embryotransferering). De seks biokemiske graviditeter resulterede i to kliniske graviditeter, én er igangværende og én har født (tvillinger). Der er i alt oplagt 25 embryoner, og implantationsraten er således 12% (Tabel 1).
Diskussion
Denne rapport er baseret på et lille materiale, men illustrerer, at PGD lader sig praktisere i Danmark på udvalgte sygdomme med graviditetsrater, som er sammenlignelig med, hvad der opnås ved almindelig IVF, og på niveau med de generelle europæiske resultater (5, 9).
Principielt kan PGD erstatte almindelig prænatal diagnostik. Fordelen ved PGD sammenlignet med prænatal diagnostik er, at diagnosen sygt foster stilles inden implantationen, hvorved svangerskabsafbrydelse på grund af afficeret foster kan undgås. Ulemperne ved PGD er dels at teknikken forudsætter IVF-behandling, en dyr og ofte ubehagelig procedure for patienten, dels at den molekylærbiologiske diagnostik er overordentlig krævende, da den baseres på det genetiske materiale fra én celle, den udtagne blastomer.
Det er derfor nødvendigt at optimere eksisterende PCR-teknikker til hver enkelt monogent arvelig sygdom. Desuden anvendes informative markører til verifikation af, at analysen er foretaget på patients arvemateriale og ikke på forurenende DNA.
Nødvendigheden af IVF-behandling vil formentlig betyde, at de færreste potentielle kandidater til PGD vil vælge denne metode som første valg. Det må derfor forventes, at PGD til monogent arvelige sygdomme vil få et beskedent omfang. Man har i Storbritannien vurderet et behov svarende til 256 par per år svarende til ca. fire par per million indbyggere. Dette svarer til ca. 20-25 par per år i Danmark eller ca. 50 PGD-behandlinger. Hertil kommer dog behovet i forbindelse med strukturelle kromosomabnormiteter, specielt translokationer, som forekommer med en hyppighed af ca. 3% hos mænd med stærkt nedsat sædkvalitet (10).
Det er ikke sandsynligt, at blastomerbiopsi indebærer risiko for barnet. Enæggede tvillinger er resultat af en naturlig adskillelse af blastomerer, og i IVF-kulturer af embryoner samt efter nedfrysning observeres ikke sjældent degeneration af én eller flere blastomerer i et embryon med efterfølgende fødsel af normale børn. De foreløbige erfaringer med omhyggelig opfølgning af de fødte børn efter PGD tyder på en normal risiko for malformationer (5, 9), men tallene er endnu små. Usikkerheden vedrørende mulige risici ved PGD kunne spille en rolle for, at man her i landet reserverer PGD til særlig alvorlige sygdomme.
Frekvensen af uaflæselige svar ved PCR i nærværende undersøgelse (45%) kan forekomme høj, men er tilfredsstillende ved FISH (18%). At kun 55% gav et sikkert aflæseligt diagnosesvar, er udtryk for laboratoriets restriktive holdning over for uklare signaler for at minimere risiko for fejldiagnose.
Diagnosesikkerheden ved PGD-teknikken er formentlig høj, uanset om der anvendes PCR eller FISH (11). PCR-diagnostik kan give fejlagtig diagnostik i tilfælde af såkaldt allel drop-out eller ved præferentiel amplifikation, hvor kun den raske allel opformeres i fuldt omfang. Ligeledes er der en risiko for kontaminering, idet kun en enkelt eller to cellers arvemateriale undersøges. Risikoen for fejlagtig implantering af et sygt embryon kan formentlig reduceres til <1%, men er afhængig af, hvordan diagnostikken udføres (fx PCR-teknik, anvendelse af markører, diagnostik på én eller to celler) (12). Ved FISH-teknikken er risikoen manglende hybridisering med de fluorescerende prober, eller at to farvede pletter dækker over hinanden. Risikoen for fejldiagnose skønnes <1% ved kønsdiagnostik. Ved translokationsdiagnostik er risikoen for fejldiagnose formentlig højere, omkring 6% ved analyse af én celle (13), men kan dog reduceres til ca. 1%, hvis to blastomerer fra samme befrugtede æg undersøges. Større, systematiske undersøgelser af risikoen for fejldiagnose med FISH ved PGD findes dog ikke. En anden mulig fejlkilde kan være mosaicisme i det tidlige embryon (14). PGD-teknikken giver således en risikoreduktion og ikke en elimination af risiko for sygt barn. Af den grund bør alle par, der får foretaget PGD, indtil videre tilbydes prænatal diagnostik. Parrenes fordel ved PGD er således på nuværende tidspunkt ikke undgåelse af prænatal diagnostik, men minimering af risiko for at skulle have foretaget provokeret abort som følge af påvist sygt foster.
Som det ses af nærværende opgørelse, er der et tab af oocytter og embryoner på alle trin i processen. Det væsentligste tab sker under dyrkningen frem til 8-cellestadiet samt ved frasorteringen af homozygot syge embryoner (recessivt arvelige sygdomme) eller hanlige embryoner (kønsbundne sygdomme).
Kun 63% af de udtagne oocytter udviklede sig til et embryon, som var egnet til biopsi. Dette er et velkendt problem og kan skyldes, at de nuværende dyrkningsbetingelser er suboptimale, eller en biologisk bestemt aneuploidirisiko (15). Tabet af oocytter og embryoner forklarer, hvorfor det generelt anbefales, at der udtages mindst seks og helst mindst ni oocytter fra disse patienter (16).
Summary
Hans Jakob Ingerslev, Johnny Hindkjær, Cathrine Jespersgaard, Margit Palmer Lind og Steen Kølvraa:
Preimplantation genetic diagnosis. The first experiences in Denmark.
Ugeskr Læger 2001; 163: 5525-8.
Introduction: Preimplantation genetic diagnosis (PGD) is a possible alternative to prenatal diagnosis, whereby families with serious inherited diseases can avoid having children with the disease. The genetic diagnosis is performed on embryos before implantation and therefore implies IVF. Hence, PGD offers the possibility of transferring embryos without disease, thereby avoiding termination of pregnancy owing to an affected fetus.
Material and methods: Activities at the Centre for Preimplantation Genetic Diagnosis at Aarhus University Hospital since its opening in February 1999 are described. The fluorescent in situ hybridisation (FISH) technique was used for sex selection (hemophilia A and Duchenne's muscular dystrophy) and translocations. The polymerase chain reaction (PCR) was used for cystic fibrosis.
Results: Of 20 PGD cycles started, 15 were successful in terms of transference of healthy or carrier embryos. A positive pregnancy test was found after six of 15 embryo transfers (40%) with two subsequent clinical pregnancies.
Conclusions: The present pregnancy rates with PGD are comparable to those following IVF; the clinical pregnancy rate may seem low, but the cycle numbers are small. Preimplantation genetic diagnosis seems to be a realistic alternative for selected genetic diseases, in cases where the couple find abortion unacceptable.
Reprints not available. Correspondence: Hans Jakob Ingerslev, Fertilitetsklinikken, Skejby Sygehus, DK-8200 Århus N.
Projektet er støttet af Statens Sundhedsvidenskabelige Forskningsråd, bevilling no. 9802628. Veluxfonden har givet støtte til indkøb af udstyr. Medicinalfirmaet Organon takkes for økonomisk støtte til løn og apparatur.
Litteratur
1. Handyside AH, Peneketh RJA, Winston RML, Pattinson JK, Delhanty JDA, Tuddenham EGD. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet 1989; 1: 347-9.
2. Harper JC. Preimplantation diagnosis of inherited diseases by embryo biopsy: an update of the World figures. J Assist Reprod Genet 1996; 13: 1-6.
3. Lissens W, Sermon, K. Preimplantation genetic diagnosis: current status and new developments. Hum Reprod 1997; 12: 1756-61.
4. VerlinskyY, Kuliev A. Preimplantation genetic diagnosis. Reprod Med Rev 1999; 7: 1-10
5. EHSRE PGD Consortium Steering Committee. ESHRE Preimplantation Genetic Diagnosis Consortium: preliminary assesssment of data from January 1997 to September 1998. Hum Reprod 1999; 14: 3138-48.
6. Lov om Kunstig befrugtning i forbindelse med lægelig behandling, diagnostik og forskning m.v. af 10. juni 1997
7. Sundhedsstyrelsens vejledning om kunstig befrugtning og anden reproduktionsfremmende behandling af 30. september 1997.
8. Van Steirteghem AC, Nagy Z, Joris H, Liu J, Staessen C, Smitz J, Wisanto A, Devroey P. High fertilization and implantation rates after intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod 1993; 8: 1061-6.
9. EHSRE PGD Consortium Steering Committee. ESHRE Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) Consortium: data collection II (May 2000). Hum Reprod 2000; 15: 2673-83.
10. Tuerlings JH, de France HF, Hamers A, Hordijk R, Van Hemel JO, Hansson K et al. Chromosome studies in 1792 males prior to intra-cytoplasmic sperm injection: the Dutch experience. Eur J Hum Genet 1998; 6: 194-200.
11. Harper JC, Wells D. Recent advances and future developments in PGD. Prenat Diagn 1999; 19: 1193-9.
12. Lewis CM, Pinêl T, Whittaker JC, Handyside AH. Controlling misdiagnosis errors in preimplantation genetic diagnosis: a comprehensive model encompassing extrinsic and intrinsic sources of error. Hum Reprod 2001; 16: 43-50.
13. Munne S, Sandalinas M, Escudero T, Fung J, Gianaroli L, Cohen J. Outcome of preimplantation genetic diagnosis of translocations. Fertil Steril 2000; 73: 1209-18.
14. Kuo HC, Ogilvie CM, Handyside AH. Chromosomal mosaicism in cleavage-stage human embryos and the accuracy of single-cell genetic analysis J Assist Reprod Genet 1998; 15: 276-80.
15. Gianaroli L, Magli MC, Ferraretti A.P, Munne S. Preimplantation diagnosis for aneuploidies in patients undergoing in vitro fertilization with a poor prognosis: identification of the categories for which it should be proposed. Fertil Steril 1999; 72: 837-44.
16. Vandervorst M, Liebaers I, Sermon K, Staessen C, De Vos A, Van de Velde H et al. Successful preimplantation genetic diagnosis is related to the number of available cumulus-oocyte complexes. Hum Reprod 1998; 13: 3169-76.
Antaget den 14. maj 2001.
Center for Præimplantationsdiagnostik ved Århus Universitetshospital,
Århus Universitetshospital, Skejby Sygehus, Fertilitetsklinikken, og
Århus Universitetshospital, Århus Kommunehospital, afdeling for klinisk genetik.
|
|
|
|
UGESKRIFT FOR LÆGER
Ugeskriftet betinger sig ret til at opbevare og publicere artikler (tekst og illustrationer) også i elektronisk form, fx via cd-rom og Internettet.
Eftertryk eller anden mangfoldiggørelse af Ugeskriftets tekst og illustrationer er kun tilladt med skriftlig tilladelse fra forfatter og redaktion og anførelse af Ugeskrift for Læger som kilde.
Gengivelse af informationer eller citater fra Ugeskriftet må tidligst offentliggøres på datoen (mandage) for det pågældende nummers udgivelse og med angivelse af Ugeskrift for Læger som kilde. |
|
|
|
|
|
