|
|
|
| Ugeskr Læger 2001;163(40):5491
|
Potentielle anvendelser i celle- og genterapi ved knogletab forårsaget af aldring og osteoporose
OVERSIGTSARTIKEL
Cand.scient. Jeannette Justesen, cand.scient. Karin Stenderup &Moustapha S. Kassem
Resumé
Mesenkymale stamceller (MSC) findes i knoglemarven og kan give ophav til flere forskellige celletyper, inklusive osteoblaster, kondrocytter, adipocytter og myocytter. Differentiering af MSC er baseret på aktivering af celletypespecifikke transkriptionsfaktorer. MSC er vigtige for knoglemodellering og -remodellering, hvor de danner osteoblaster nødvendige for knogleformationen. Humane studier har vist, at antallet og differentieringspotentialet af MSC er uændret med alderen og hos patienter med osteoporose.
I de senere år har der været en tiltagende interesse for anvendelse af MSC i klinikken, hvor man har anvendt MSC til at fremme heling af knoglefrakturer. Nogle dyrestudier har vist, at ved i.v. infusion kan MSC finde vej til knogle og muligvis deltage i knogleformationen. Disse studier er begyndelsen af en ny æra, hvor autologe in vitro-ekspanderede MSC eller gen-modificerede MSC vil være en potentiel behandlingsmulighed for at øge knogleformationen hos patienter med diverse metaboliske og genetiske knoglesygdomme, inklusive osteoporose.
Tilstedeværelsen af en ikke-hæmatopoietisk, mesenkymal stamcelle i knoglemarven har været foreslået i mere end 130 år (1). Det var dog ikke før i 1960'erne, at Friedenstein et al demonstrerede, at dyrkning af uoprenset knoglemarv kunne give ophav til en gruppe af ikke-hæmatopoietiske celler, der var i stand til at adhærere til dyrkningsflaskernes plastik og danne kolonier med fibroblastlignende morfologi. Cellerne blev af Friedenstein et al og senere af Owen kaldt for colony forming units-fibroblastic (CFU-F). I de senere år er denne CFU-F-cellepopulation i knoglemarven blevet kaldt mesenkymale stamceller eller marvstromaceller (MSC), og man kan påvise, at disse celler kan differentieres til flere celletyper, inklusive osteoblaster, kondrocytter, adipocytter, fibroblaster, myocytter og astrocytter (2-4). MSC findes i lav koncentration i knoglemarven (1 MSC per 105 mononukleære marvceller) og har desuden et højt proliferativt potentiale. MSC kan dyrkes in vitro i op til 35 populationsdoblinger, hvilket repræsenterer en forøgelse i celleantallet på 3´1010 (5).
Karakteristiske overfladeantigener på MSC
Man har endnu ikke påvist specifikke overflademarkører på MSC, og deres lave antal i marven gør det utrolig vanskeligt at isolere en homogen population af MSC. Gennem en årrække har man arbejdet med at udvikle monoklonale antistoffer, som kan anvendes til identifikation af MSC og tidlige udviklingsstadier af osteoblasten i knoglemarven. De mest lovende antistoffer er STRO-1 (6) og HOP26, der vides at identificere både MSC og osteoblast-progenitorceller. Derimod udtrykker MSC ikke de typiske hæmatopoietiske markører såsom fx CD13, CD33, CD14 eller T- og B-cellemarkører (3). Karakteristika for MSC er angivet (Tabel 1 [se UFL 163/40, p. 5492, 1. oktober 2001]).
Knoglemarven indeholder MSC, en multipotent celle i stand til at differentiere til osteoblaster, kondrocytter, adipocytter, fibroblaster, myocytter og astrocytter. Den enkelte differentiering er bestemt af specifikke transkriptionsfaktorer. Med alderen ses ingen ændringer i antallet af MSC eller deres differentieringspotentiale.
Differentieringsmekanismer afmesenkymale stamceller
Både in vivo- og in vitro-undersøgelser har vist, at MSC har evne til at differentiere til flere forskellige celletyper (Fig. 1 [se UFL 163/40, p. 5492, 1. oktober 2001]). For humane celler er differentiering til osteoblaster, adipocytter, kondrocytter og fibroblaster blevet påvist (2, 3). De molekylære mekanismer, som inducerer den cellelinie-specifikke differentiering er endnu ikke kendt i detaljer, men differentieringsprocessen er afhængig af DNA-bindende proteiner – de såkaldte transkriptionsfaktorer. Transkriptionsfaktorer fungerer som master genes, der, når de bliver aktiveret, inducerer en kaskade af protein-gen-interaktioner med det endelige resultat, at den cellelinie-specifikke proteinproduktion øges. Induktion af transkriptionsfaktorer er afhængig af hormon- og vækstfaktorregulering.
Osteoblast-differentiering
Osteoblast-differentiering er afhængig af transkriptionsfaktoren Cbfa1 (core binding factor alpha 1). Homozygote mus, der mangler Cbfa1 (Cbfa1 knockout), dør kort efter fødslen pga. åndedrætsbesvær, hvilket skyldes manglende knogledannelse på trods af stort set uændret bruskskelet. Undersøgelser af de heterozygote knockout-mus viser bl.a. hypoplasi af klaviklen samt forsinket ossifikation af kranie- knoglerne, således at åbne anteriore og posteriore fontaneller såvel som brede suturer i kraniet observeres. Alt i alt minder dette om sygdommen dysplasia cleidocranialis (CCD) (7, 8).
Undersøgelser af patienter med CCD har vist, at de bærer forskellige mutationer i Cbfa1-genet. In vitro-undersøgelser har demonstreret, at Cbfa1 er vigtig for transkriptionen af osteoblast-relevante gener såsom type I-kollagen, osteopontin, osteocalcin og transforming growth factor beta (TGFb)-receptor I. Desuden er Cbfa1 reguleret af BMP2 (bone morphogenetic protein 2), som kan inducere osteogenese. Gluko-kortikoid hæmmer genekspressionen af Cbfa1, en mekanisme som kan være medvirkende til den nedsatte knogleformation, der ses under glukokortikoidbehandling in vivo.
Adipocyt-differentiering
In vitro kan MSC differentieres til adipocytter ved dyrkning i medium der indeholder sera fra heste eller kaniner (berigede i polyumættede fedtsyrer) samt tilsætning af glukokortikoid. Disse faktorer øger genekspressionen og aktivering af peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARg), som er en adipocyt-specifik transkriptionsfaktor (9, 10), der initierer adipocyt-differentiering og dannelsen af modne adipocytter. Andre ligander for PPAR-g er bl.a. thiazolidinedioner (fx troglitazone) og prostaglandinderivater.
Kondrocyt-differentiering
MSC kan differentieres til kondrocytter under passende dyrkningsomstændigheder, hvilket omfatter høj cellekoncentration, lavt ilttryk, tilstedeværelse af glukokortikoid og TGFb3. Kontrollen ved kondrogenese er mindre kendt. En af de faktorer, der muligvis spiller en rolle, er den kønsbestemmende faktor SOX9. Mutationer i genet for SOX9 hos mennesker har vist sig at medføre sygdommen campomelic dysplasia karakteriseret ved deforme knogler pga. manglende bruskudvikling. Det er imidlertid sandsynligt, at andre transkriptionsfaktorer medvirker under kondrogenesen.
Myocyt-differentiering
Differentieringen af MSC til myocytter fremmes in vitro vha. 5-azacytidinebehandling. Myocyt-differentieringen giver et godt eksempel på, at differentiering kan være bestemt vha. et enkelt mastergen, i dette tilfælde medlemmer af transkriptionsfaktorfamilien MyoD. MyoD er kun udtrykt i muskelceller, og familien består af fire medlemmer: MyoD, Myf-5, MRF4 (Myf-6) og myogenin.
Andre celledifferentieringsmuligheder
Nyere undersøgelser har vist, at MSC kan differentiere til nerveceller (11), endotelceller og kardiomyocytter. De molekylære mekanismer bag disse differentieringsmuligheder er endnu ukendte.
Lokalt finder ex vivo-ekspanderede MSC klinisk anvendelse ved heling af knoglebrud, og det er vist, at MSC-transplantering kan systemisk tolereres uden væsentlige problemer. Hos patienter med osteogenesis imperfecta har MSC-transplantering øget antallet af osteoblaster og nedsat antallet af frakturer.
MSC's rolle i skelettets fysiologi
Skelettet er et dynamisk organ, som vedvarende regenereres via knogleremodellering. Knogleremodelleringen foregår i både kortikal og trabekulær knogle og udgør summen af de cellulære processer, der er involveret i udskiftningen af gammelt knoglevæv med nyt. Initialt stimuleres en gruppe osteoklaster (knogleresorberende celler), der fjerner knoglematrix og mineral, hvorved en resorptionslakune skabes. Herefter vil en gruppe osteoblaster opfylde resorptionslakunen med ny knoglematrix, der senere mineraliserer. En negativ balance mellem resorption og formation giver ophav til et knogletab med alderen og osteoporose samtidig med en øget trabekelperforering. Nedsat knogleformation spiller tilsyneladende en meget afgørende rolle for knogletabet (12).
Nedsat knogleformation kan skyldes en nedsat rekruttering af osteoblaster i begyndelsen af knogleformationsfasen fra MSC i knoglemarven. Aldersbetingede ændringer i antallet af MSC er blevet undersøgt både hos dyr og hos mennesker med varierende resultat. Nogle humane studier finder et fald i antal af MSC med alderen, mens andre finder et uændret (13) antal MSC. Dog ses det største fald i antallet af MSC i de første 20-30 år af livet, hvilket svarer til den periode, hvor skelettet modelleres og modnes.
Generelt for alle de humane studier er, at efter 30-års-alderen er antallet af MSC stabilt.
Nedsat osteoblast-differentiering fra MSC kan medføre øget knogletab. Histologiske studier af knoglebiopsier fra forskellige donorer med forskellig alder har vist, at indholdet af adipøst væv stiger med alderen og er associeret med et fald i mængden af knoglemasse (14). Vi har undersøgt in vitro-differentieringspotentialet af knoglemarvsceller fra unge såvel som ældre donorer uden at observere en ændring i deres osteoblast- eller adipocyt-differentieringspotentiale med alderen (15). Det observerede aldersbetingede fald i knogleformationen og den forøgede mængde af adipøst væv kan derfor være betinget af ændringer i det hormonelle miljø i knoglemarven, som nedsætter osteoblastrekruttering og fremkalder adipocyt-differentiering frem for osteoblast-differentiering. Ændringer i hormoner (fx kønshormoner, parathyroideahormon (PTH)), vækstfaktorer eller cytokiner (fx TGF, insulin-like growth factor (IGF) og interleukiner) kan muligvis forklare disse aldersbetingede forandringer, men de relative bidrag fra de forskellige faktorer såvel som deres indbyrdes interaktioner er stadig ikke bestemt.
Ændringer af MSC ved osteoporose
Osteoporose er en sygdom karakteriseret ved nedsat knoglemasse, øget antal perforationer af trabekulært netværk og udtalt fragilitet af skelettet, hvilket medfører øget risiko for frakturer ved mindre traumer. Kun få studier har undersøgt MSC isoleret fra patienter med osteoporose. Generelt har man fundet, at osteoporotiske celler responderer på stimuli, fx serum, væksthormon og calcitriol, på samme måde som normale celler isoleret fra raske aldersrelaterede donorer (16). Vi fandt ingen ændringer i antallet af MSC hos en uselekteret gruppe af patienter med osteoporose sammenlignet med aldersrelaterede kontrolpersoner (13).
Ændringer af MSC ved fibrøs dysplasi
Fibrøs dysplasi er en sporadisk udviklingssygdom karakteriseret ved unifokale, eller multifokale ekspanderende knoglelæsioner, der hyppigst involverer femur, tibia og ansigtsskelettet. McCune-Albrights syndrom omfatter fibrøs dysplasi sammen med karakteristisk hudpigmentering (café au lait- pletter) og hyperfunktion af en eller flere endokrine kirtler. MSC dyrket fra patienter med fibrøs dysplasi viser, at de har mutationer i genet for det guanin-nukleotid-bindende protein (Gsa-underenheden), og at disse celler danner abnorm knoglematrix in vivo (17). Fibrøs dysplasi må derfor betragtes som en specifik sygdom lokaliseret til MSC. Den dokumenterede rolle, MSC har ved fibrøs dysplasi, kunne tyde på, at MSC spiller en rolle i udviklingen af andre metaboliske knoglesygdomme, fx Pagets sygdom, myelomatose og osteopetrose, men den eksakte rolle er i øjeblikket ukendt.
Klinisk anvendelse af MSC
På grund af MSC's høje proliferative kapacitet har man påbegyndt anvendelse af MSC i kliniske forsøg med det formål at reparere knoglefrakturer. MSC har været anvendt til lokal behandling af ikke-helende frakturer, fx har injektion af knoglemarv ved brud fremmet helingen i samme grad og hastighed som standard operativ knogletransplantering.
Tabel 2 (se UFL 163/40, p. 5493, 1. oktober 2001) giver en oversigt over de områder, hvor man har anvendt MSC i klinikken. Desuden har man anvendt demineraliseret knoglepulver, hydroxyapatit og Collagraft som vehikler for MSC. Bucholz et al sammenlignede trabekulært autotransplantat med porøs hydroxyapatit til brug ved heling af tibiale plateaufrakturer og fandt, at porøs hydroxyapatit er lige så effektiv som autogen knoglegraft. I et randomiseret multicenter forsøg udført med 267 patienter, fik 128 patienter trabekulært autotransplantat og 139 patienter Collagraft blandet med autogen knoglemarv. Seks og 12 måneders opfølgning viste, at Collagraft tilsat knoglemarv forøger knogleheling lige så effektivt som autogent knogletransplantat. Derudover har man i et præliminært studie af kaniner kunnet påvise, at in vitro-dyrkede MSC overført til en kollagenmatrix er i stand til at reparere defekter i akillessenen.
I den senere tid har man spekuleret på, om knogleformation og knoglemasse kan øges ved transplantering med MSC. Der findes endnu ingen studier som har undersøgt effekten af MSC-transplantation i osteopeniske dyremodeller. I et humant studie har Lazarus et al vist, at patienter kan tolerere MSC-transplantering uden væsentlige problemer (18).
I studiet af Horwitz et al (19, 20) har fem børn, der led af udtalt osteogenesis imperfecta, modtaget knoglemarvstransplantering fra helt eller delvist HLA-relaterede søskende, og behandlingen har vist klinisk forbedring i form af forøget antal osteoblaster, dannelse af ny lamellær knogle, øget knoglemineraldensitet og knoglevækst samt nedsat antal frakturer. De kliniske resultater er formentlig betingede af transplantering af MSC sammen med knoglemarven. Da studiet ikke er randomiseret og omfatter få patienter, skal det betragtes som et proof-of-concept, der antyder, at transplanterede MSC kan finde vej til knogle og danne normal knoglematrix. Enkelte dyrestudier støtter, at MSC kan finde vej til knogle efter i.v. injektion. Cui et al viste, at 17% af de injicerede MSC i mus findes i knoglen. Selv om MSC også kan finde vej til andre organer, er der ingen tegn på ektopisk knogledannelse. Dette tyder på, at den knogledannende aktivitet af MSC er afhængig af det lokale hormonelle miljø, der findes i knoglemarven og tæt ved knogleoverfladen. Der er mange spørgsmål, som skal besvares, før MSC-transplantering er et praktisk tilbud til patientbehandling. For eksempel er det ukendt, i hvilken grad man kan øge knogleformation ved infusion af MSC alene. Kan recipient-MSC interferere med donor-MSC? Hvor lang tid kan MSC fungere in vivo? Skal man bruge systemisk infusion af MSC, eller skal man bruge lokal infusion? Hvor stor en fraktion af MSC finder vej til knogle, og hvilke faktorer er bestemmende herfor? Kan de transplanterede MSC genetablere det perforerede trabekulære netværk, som forårsager nedsat knoglestyrke ved osteoporose? Alle disse spørgsmål er underlagt intensiv forskning i øjeblikket.
Fremtidige perspektiver
Den nuværende etablerede behandling af knogletab ved osteoporose er domineret af antiresorptive medikamenter (østrogen, raloxifen, bisfosfonater), der nedsætter knogleomsætningen, og derfor stabiliserer knoglemassen. Den optimale behandling af lav knoglemasse bør imidlertid indebære en øgning af knoglemængden. Brug af MSC eller genetisk modificerede MSC kan åbne muligheden for nye behandlingsprincipper af knogletab (Fig. 2 [se UFL 163/40, p. 5494, 1. oktober 2001]). Der er også muligheder for at anvende lignende metoder til at få bedre frakturheling hos patienter med brud, herunder osteoporosepatienter, samt at behandle andre metaboliske knoglesygdomme (fx osteogenesis imperfecta, hypofosfatasi, osteopetrose, fibrøs dysplasi). Forståelse af MSC's biologi og funktion er imidlertid en forudsætning for at kunne beherske disse fremtidige behandlingsprincipper.
Summary
Jeannette Justesen, Karin Stenderup &Moustapha S. Kassem:
Mesenchymal stem cells. Potential use in cell and gene therapy for bone loss caused by ageing and osteoporosis.
Ugeskr Læger 2001; 163: 5491-5.
Mesenchymal stem cells (MSC) originate from bone marrow and give rise to various cell types, including osteoblasts, chondrocytes, adipocytes, and myocytes. Lineage-specific differentiation is dependent on activation of specific transcription factors. MSCs play an important role in bone modelling and remodelling where they give rise to the osteoblasts necessary for bone formation. Human studies have shown that the number and differentiation potential of MSC are unchanged with age and osteoporosis.
In recent years, there has been an increasing interest in the clinical use of MSCs. These have been used to augment healing of bone fractures. Some animal studies have shown that MSCs infused intravenously target bone and possibly participate in bone formation. These studies represent the beginning of a new era, where transplantation with autologous MSCs or genetically-modified MSCs expanded in vitro is a potential treatment strategy to augment bone formation in patients with diverse metabolic and genetic bone diseases, including osteoporosis.
Reprints: Moustapha S. Kassem, medicinsk endokrinologisk afdeling M, Odense Universitetshospital, DK-5000 Odense C. E-mail: mkassem@dadlnet.dk
Litteratur
1. Prockop DJ. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science 1997; 276: 71-4.
2. Rickard DJ, Kassem M, Hefferan TE, Sarkar G, Spelsberg TC, Riggs BL. Isolation and characterization of osteoblast precursor cells from human bone marrow. J Bone Miner Res 1996; 11: 312-24.
3. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999; 284: 143-7.
4. Pereira RF, Halford KW, O'Hara MD, Leeper DB, Sokolov BP, Pollard MD et al. Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice. Proc Natl Acad Sci USA 1995; 92: 4857-61.
5. Stenderup K, Justesen J, Eriksen EF, Kassem M. Ageing is associated with decreased proliferative potential of human bone marrow osteoprogenitor cells in vitro. Bone 2000; 26: 11S.
6. Gronthos S, Graves SE, Ohta S, Simmons PJ. The STRO-1+ fraction of adult human bone marrow contains the osteogenic precursors. Blood 1994; 84: 4164-73.
7. Komori T, Yagi H, Nomura S, Yamaguchi A, Sasaki K, Deguchi K et al. Targeted disruption of Cbfa1 results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts. Cell 1997; 89: 755-64.
8. Otto F, Thornell AP, Crompton T, Denzel A, Gilmour KC, Rosewell IR et al. Cbfa1, a candidate gene for cleidocranial dysplasia syndrome, is essential for osteoblast differentiation and bone development. Cell 1997; 89: 765-71.
9. Tontonoz P, Hu E, Graves RA, Budavari AI, Spiegelman BM. mPPAR gamma 2: tissue-specific regulator of an adipocyte enhancer. Genes Dev 1994; 8: 1224-34.
10. Ristow M, Muller-Wieland D, Pfeiffer A, Krone W, Kahn CR. Obesity associated with a mutation in a genetic regulator of adipocyte differentiation. N Engl J Med 1998; 339: 953-9.
11. Kopen GC, Prockop DJ, Phinney DG. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 10711-6.
12. Kassem MS, Mosekilde L, Eriksen EF. Patofysiologien bag det aldersrelaterede knogletab. Ny indsigt i cellulære og molekylærbiologiske mekanismer. Ugeskr Læger 1999; 161: 5663-6.
13. Stenderup K, Justesen J, Eriksen EF, Kassem M. Number and proliferative capacity of osteogenic stem cells are maintained during aging and in patients with osteoporosis. J Bone Miner Res 2001; 16: 1120-9.
14. Justesen J, Stenderup K, Ebbesen EN, Mosekilde Li, Steiniche T, Kassem M. Adipocyte tissue volume in bone marrow is Increased with aging and in patients with osteoporosis. Biogeron 2001; 2: 165-71.
15. Justesen J. Effect of ageing and osteoporosis on adipocyte cell differentiation in human bone marrow. Institut for Molekylær og Strukturel Biologi, Aarhus Universitet 1999; 1-54 (kandidatspeciale).
16. Kassem M, Brixen K, Mosekilde L, Eriksen EF. Human marrow stromal osteoblast-like cells do not show reduced responsiveness to in vitro stimulation with growth hormone in patients with postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int 1994; 54: 1-6.
17. Bianco P, Kuznetsov SA, Riminucci M, Fisher LW, Spiegel AM, Robey PG. Reproduction of human fibrous dysplasia of bone in immunocompromised mice by transplanted mosaics of normal and Gsalpha-mutated skeletal progenitor cells. J Clin Invest 1998; 101: 1737-44.
18. Lazarus HM, Haynesworth SE, Gerson SL, Rosenthal NS, Caplan AI. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow-derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use. Bone Marrow Transplant 1995; 16: 557-64.
19. Horwitz EM, Prockop DJ, Gordon PL, Koo WW, Fitzpatrick LA, Neel MD et al. Clinical responses to bone marrow transplantation in children with severe osteogenesis imperfecta. Blood 2001; 97: 1227-31.
20. Horwitz EM, Prockop DJ, Fitzpatrick LA, Koo WW, Gordon PL, Neel M et al. Transplantability and therapeutic effects of bone marrow-derived mesenchymal cells in children with osteogenesis imperfecta. Nat Med 1999; 5: 309-13.
Ovenstående oversigtartikel hviler på en større litteraturgennemgang end litteraturlistens 20 numre. Oplysninger om denne baggrundslitteratur kan fås fra forfatteren.
Denne artikel bringes som led i Ugeskrift for Lægers serie i anledning af Bevægeapparatets årti.
Antaget den 22. maj 2001.
Århus Amtssygehus, medicinsk endokrinologisk afdeling C, og
Odense Universitetshospital, medicinsk endokrinologisk afdeling M.
|
|
|
|
UGESKRIFT FOR LÆGER
Ugeskriftet betinger sig ret til at opbevare og publicere artikler (tekst og illustrationer) også i elektronisk form, fx via cd-rom og Internettet.
Eftertryk eller anden mangfoldiggørelse af Ugeskriftets tekst og illustrationer er kun tilladt med skriftlig tilladelse fra forfatter og redaktion og anførelse af Ugeskrift for Læger som kilde.
Gengivelse af informationer eller citater fra Ugeskriftet må tidligst offentliggøres på datoen (mandage) for det pågældende nummers udgivelse og med angivelse af Ugeskrift for Læger som kilde. |
|
|
|
|
|
